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Terapia com células-tronco mesenquimais derivadas da fração vascular estromal do tecido adiposo como tratamento adjuvante em feridas vasculares crônicas

AUTORES: Felipe Figueiró Teixeira, Marco Carneiro Teixeira, Vinícius Lemos de Carvalho Lima, Daniel Dias Lustoza Cabral, Cristina Juliana Georg Ferreira, Patricio Centurion , Guilherme Miranda de Freitas, Marcelo Oliveira e Silva.

INTRODUÇÃO
Ferida crônica pode ser definida como aquela cujo ciclo de cicatrização encontra-se fisiologicamente prejudicado, permanecendo supostamente estacionada na fase inflamatória e não respeitando o processo sequencial de cura. Isso pode ser causado, dentre outros motivos, por má nutrição, por curativos inadequados ou por comprometimento da angiogênese, da inervação ou da migração celular [1].
Nessa perspectiva, a terapia padrão atual para feridas crônicas baseia-se em impedir complicações geradas por um colapso epitelial, como infecção ou perda de fluido, por exemplo. Contudo, é bem conhecido que o processo de cicatrização é uma ação altamente metabólica, que requer nutrientes e oxigênio em grande quantidade. Ao avaliar-se esse processo em feridas crônicas, um microambiente adverso é percebido, com perfil alterado de citocinas e diminuição da expressão de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e de células progenitoras endoteliais circulantes (EPCs) [2].
Para dimensionar a gravidade do problema, vale destacar que úlceras isquêmicas em pés diabéticos são a causa de, pelo menos, dois terços das amputações não traumáticas que ocorrem nos Estados Unidos [3] e que, além disso, o tratamento dessa doença é fator de grande número de internações. Ademais, elas têm uma alta taxa de readmissão hospitalar e estão associadas a um risco 2,5 vezes maior de óbitos quando comparado com pacientes diabéticos sem úlceras [4,5].
Sabendo do enorme encargo pessoal sobre os indivíduos afetados, com redução significativa da qualidade de vida, da alta taxa de recorrência e do significativo custo dessas feridas crônicas para o sistema de saúde, a busca por novas terapias com o objetivo de melhoria do tratamento clínico tornou-se essencial nesse campo de atuação.
Assim, dentre as novas terapias relacionadas à medicina regenerativa, a terapia celular avançada vem ganhando cada vez mais espaço. Células-tronco distinguem-se das demais células pela sua capacidade de multiplicação e diferenciação, uma vez que podem dar origem a novas células-tronco ou a células especializadas, respectivamente.
Mais especificamente, células-tronco mesenquimais (MSCs) são uma fonte atraente de células-tronco adultas imaturas para a regeneração de tecidos danificados, visto que se caracterizam como células indiferenciadas – isto é, ainda não possuem uma função ou especialização definida -, e com alta capacidade proliferativa, além de potencial diferenciação mesodérmica [6].
É importante destacar que muitos fatores influenciam as propriedades de diferenciação, de multiplicação e de imunomodulação dessas células, um deles é a característica do tecido a
partir do qual elas são obtidas. Alguns exemplos de fontes de MSCs são: tecido adiposo, medula óssea, cordão umbilical, placenta, pele e tecidos dentários.
A partir de estudos sobre o tema, o tecido adiposo vem sendo considerado uma fonte interessante para captação devido a sua facilidade de extração com procedimentos minimamente invasivos e a uma maior disponibilidade de MSCs quando comparado à medula óssea [7].
Do ponto de vista da segurança, o processo de enxerto composto autólogo que inclui a fração estromal vascular (SVF) e os adipócitos como veículo é amplamente utilizado em cirurgias plásticas estéticas e reparadoras atualmente.
Neste artigo, serão discutidos os componentes celulares do tecido adiposo, com ênfase na fração vascular estromal (SVF), e como eles podem estar envolvidos na regeneração tecidual.

MÉTODO
A partir dos resultados que demonstram que o transplante autólogo de células-tronco mesenquimais de origem estromal derivadas do tecido adiposo (MSCs) apresentam um perfil de segurança aceitável e possuem populações de células com propriedades regenerativas, foiiniciado o tratamento compassivo em sete pacientes selecionados em centro único, entre outubro/2020 e junho/2021, cumprindo todas as determinações da Anvisa por meio da RDC Nº 214, de 7 de Fevereiro de 2018. Como a população de pacientes elegidos incluiu aqueles que estavam clinicamente muito próximos da necessidade de amputação, não houve grupo controle.
Adotaram-se como critérios de seleção pacientes vasculopatas que apresentavam feridas vasculares crônicas e complexas, com piora clínica evolutiva em duas semanas após o tratamento vascular clínico-cirúrgico adequado e otimizado, ou que já possuíam exauridas as possibilidades terapêuticas. Ou seja, foram selecionados pacientes que, após revascularização e controle infeccioso efetivo, não manifestaram nenhum sinal de melhora cicatricial da lesão.
Foram excluídos os pacientes com infecção contínua e/ou sepse, doença cardiovascular instável, doença pulmonar crônica ou doença neoplásica em atividade.
O desfecho primário adotado foi a evolução do quadro para necessidade de amputação maior, dado que, baseado na classificação WIfI da Society for Vascular Surgery (SVS) para membros inferiores ameaçados, a população de pacientes selecionados apresenta alto risco para amputação em um ano, em razão disso optamos pela seleção desses pacientes com intuito de minimizar o risco de amputação [8]. Como desfecho secundário, observou-se o processo de regeneração tecidual com a redução de área da ferida.
Coleta do material: foram coletados 80 ml de material de lipoaspiração do tecido celular subcutâneo em face medial de coxas ou em abdome inferior, em ambiente estéril, pela técnica One STEP ™ (Selective Tissue Engineering Photostimulation™) [9].
O procedimento é feito sob sedação e bloqueio regional. Primeiramente, infiltramos solução de soro fisiológico frio com adrenalina 1:500.000 em nível subcutâneo profundo, técnica úmida, sobre a fáscia muscular superficial, com cânula de Klein de 2 mm. Não foi infiltrado em plano mais superficial com o objetivo de não modificar ou diluir o tecido celular subcutâneo
rico em MSCs. Em seguida, realizamos a fotoestimulação seletiva a partir da aplicação da energia pelo laser de diodo 1210-nm (Fig. 1 A). É importante destacar que estudos recentes identificaram que esse comprimento de onda possui maior afinidade pelo tecido adiposo. O laser é aplicado em todos os níveis do tecido celular subcutâneo através de fibra óptica de
600µm. Por fim, aspiramos o tecido subcutâneo com cânula de 3,5 mm acoplada à seringa de 60 cc (Fig. 1 B) e, então, o tecido adiposo colhido foi transferido para tubos de 10 cc (Fig. 1 C), onde foi posteriormente centrifugado. Todo o processo foi realizado em circuito fechado, com manipulação mínima e, além disso, nada foi descartado, preservando-se todos os elementos
regenerativos do SVF.
Processo de isolamento das células-tronco: o lipoaspirado foi submetido a processo de curta centrifugação em baixa rotação (Fig. 1 D). Tal procedimento possui objetivo de criar um gradiente de densidade do SVF para melhor separação em camadas do fluido infranadante dos adipócitos, glóbulos vermelhos e detritos celulares. Essa separação favorece o máximo transplante estromal (Fig. 1 E-F).

Desbridamento cirúrgico: realizamos desbridamento cirúrgico através de sistema de hidrocirurgia, o qual fornece um fluxo de alta pressão de soro fisiológico estéril capaz de criar um vácuo por meio do efeito Venturi (Fig. 2 A) e, assim, otimiza a preservação do tecido viável durante o procedimento, facilitando a regeneração.
Injeção das células: o material infranadante, rico em MSCs, foi injetado em todas as bordas e no leito da ferida com agulha de ponta romba 18G (Fig. 2 B). Utilizamos o tecido adiposo sobrenadante para preenchimento e modelamento da lesão (Fig. 2 C). Por fim, realizamos cobertura dela com malha não aderente estéril de petrolato e curativo por pressão negativa
contínua a 125 mmHg (Fig. 2 D).
As trocas de curativo ocorreram a cada sete dias por equipe multidisciplinar especializada, num primeiro momento em ambiente intra-hospitalar e, após, em nível ambulatorial.

Figura 1: Processo de colheita e preparo das MSCs. A. Fotoestimulação seletiva pelo laser de diodo 1210-nm. B. Aspiração do tecido subcutâneo com cânula de 3,5 mm acoplada à seringa de 60 cc. C. Transferência do lipoaspirado para tubo estéril de 10 cc. D. Centrifugação do produto lipoaspirado. E. Gradiente em camadas após processo de centrifugação. F. Aspiração do material infranadante em seringas 10 cc e separação do tecido adiposo sobrenadante utilizado como veículo e para preenchimento cavitário.

Figura 2: Processo de Implante das MSCs e curativo. A. Desbridamento hidrocirúrgico. B. Injeção do infranadante rico em MSCs. C. Cobertura da lesão com tecido adiposo e malha não aderente estéril de petrolato. D. Curativo com pressão negativa.

RESULTADOS
Até o presente momento, os pacientes selecionados continuam em acompanhamento. Ao longo dos oito meses de observação até a produção desse artigo, nenhum paciente foi submetido à amputação maior do membro inferior, obtendo êxito em 100% do desfecho primário, resultado esse expressivo se considerado que a literatura atual revela uma taxa global média de 25% de amputação para o mesmo grupo [10].
Dos indivíduos acompanhados, cinco apresentaram fechamento da lesão, ou seja, 71% obtiveram fechamento completo, seja por segunda intenção, seja por enxerto de pele total após granulação e preenchimento da cavidade. Os demais pacientes evoluíram de uma úlcera profunda e extensa grau 3 WIfI para uma lesão superficial, granulada e com epitelização iminente grau 1 WIfI, cabe ressaltar que estes ainda estão em seguimento ambulatorial.
Embora não tenha sido avaliado como desfecho nesse artigo, observou-se uma resposta inicial à terapia já na primeira troca de curativo, em sete dias, com início da cicatrização, surgimento de tecido de granulação, sangramento do leito da ferida e presença de pontos de angiogênese.
Não houve caso de recidiva após fechamento.
É importante ressaltar que nenhuma complicação maior como morte e IAM foi observada.
Dentre as complicações menores observamos equimose em sítio de coleta em dois pacientes (28%), ambos em região inferior de abdome. Não foi observado seroma ou irregularidades visíveis.

 

Figura 3. Caso 1: Paciente feminina, 58 anos, hipertensa e diabética. Lesão espontânea extensa em calcâneo direito, submetida a revascularização com angioplastia com balão do segmento infrapatelar e desbridamento cirúrgico. A. Após 15 dias da revascularização e desbridamento. B. Após 15 dias do transplante de células-tronco. C. Após 60 dias do transplante de células-tronco.

Figura 4. Caso 2: Paciente masculino, 61 anos, hipertenso e diabético. Mal perfurante plantar infectado com lesão extensa em pé direito, submetido à revascularização com implante de stent mimético em artéria poplítea suprapatelar, angioplastia com balão do segmento infrapatelar e desbridamento cirúrgico. A-B. Após 15 dias da revascularização e desbridamento. C. Após 60 dias do transplante de células-tronco.

Figura 5. Caso 3: Paciente masculino, 77 anos, hipertenso, diabético e tabagista. Oclusão arterial aguda proveniente de outro estado, submetido à trombólise, revascularização com implante de stent em artéria femoral superficial e amputação transtársica. A. Após 15 dias da revascularização e amputação. B. Após 30 dias do transplante de células-tronco. C. Após 60 dias do transplante de células-tronco.

DISCUSSÃO

Este estudo avalia a eficácia do tratamento adjuvante com transplante autólogo de MSCs, a partir da redução do risco de amputação maior em membros inferiores nos pacientes com úlceras vasculares crônicas.

Quando o material do estroma vascular é transplantado, permite-se que as células remanescentes da área lesada se comuniquem, através da matriz extracelular, e obriguem que as células mesenquimais comecem a produzir moléculas específicas.

Entende-se que os efeitos benéficos das MSCs na regeneração tecidual provenham de sua atividade parácrina [11]. MSCs podem secretar grandes quantidades de fatores angiogênicos, como VEGF, fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs) e fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) [12].

Além disso, a partir do processo de biossinalização, MSCs também são capazes de recrutar pericitos. Esse é um momento indispensável na maturação dos vasos sanguíneos [13]. Os pericitos desempenham importante papel na manutenção da integridade vascular.

O transplante autólogo de células mesenquimais, a partir da secreção em grande quantidade de fatores angiogênicos por essas células, induz as células endoteliais ao processo de migração, de mitose e de maturação para a neoangiogenese, o que confere o suporte sanguíneo essencial para um reparo tecidual efetivo.

É importante ressaltar que o procedimento utilizado como técnica de coleta nesse estudo visa a preservar o estroma vascular para que se possa realizar um enxerto celular composto ou um transplante da parte estromal do tecido adiposo, com a vantagem de poder-se utilizar o adipócito como veículo. O SVF possui todos os elementos na quantidade necessária para regenerar os tecidos e cumpre integralmente com os requisitos da Sociedade Internacional de Terapia Celular (ISCT) para que, a partir da caracterização imunofenotípica, possa-se considerar suas células-tronco como verdadeiras MSCs [14].

Ao estimular o tecido com laser 1210 nm, realizou-se fotoestimulação na enzima colagenase endógena que está presente no tecido conectivo em estado quiescente, sendo capaz de ativá-la, fazendo-a perder sua propriedade de adesão. Tal processo permite a liberação de todos os elementos regenerativos do SVF e a preservação dos adipócitos, sem necessidade de utilização do método enzimático com colagenase. Além disso, conforme exposto neste artigo, o efeito biomodulador residual da fotoestimulação promove também angiogênese e redução da dor, ao induzir produção e liberação de EVGF e estimular a liberação de opioides endógenos, respectivamente.

Essa técnica baseia-se na propriedade fotoquímica da luz, a mesma que ocorre no processo de fotossíntese nas plantas, na qual a energia luminosa (fótons) é transformada em energia química estável, sem a presença do efeito fototérmico.

Ao se optar pelo processo de “minimal-grade manipulation” do lipoaspirado – que consiste na prática de decantação, de filtração, de centrifugação e/ou de digestão enzimática no tecido colhido, tratado e reimplantado durante a mesma sessão cirúrgica e dentro da mesma sala operatória -, além de eliminar a necessidade de um laboratório sofisticado, é possível realizar o transplante de todos os elementos do coquetel regenerativo provenientes do estroma vascular. É sabido que o transplante de todos esses componentes em conjunto mostrou-se beneficamente superior na regeneração celular ao transplante celular isolado proveniente do processo em laboratório de “high-grade manipulation” – que consiste na caracterização, na expansão, no cultivo e em todas as outras técnicas laboratoriais complementares utilizadas rotineiramente para manipulação celular num laboratório especializado [15].

Outro fator já observado foi a atividade mitocondrial do material coletado que duplica nas primeiras 24h. Isso representa um enxerto vivo e não quiescente com propriedade de interação e estimulação a partir da liberação de exosomas que sabidamente apresentam o papel de comunicação intercelular por meio do microRNA, condição indispensável para o ambiente reparador [16].

Portanto, levando em consideração que diabetes e aterosclerose contribuem para a fisiopatologia de cronificação das feridas; que a presença de isquemia associada prejudica a atividade de regeneração tecidual, motivo este que se nota pela menor probabilidade e o maior período de cicatrização, além do maior risco de recorrência e amputações [17]; e que o uso de MSCs é uma estratégia promissora para promover a angiogênese, defende-se aqui que essa terapia, pela técnica descrita, apresenta potencial para se tornar padrão-ouro no tratamento de lesões vasculares crônicas e complexas, uma vez que cumpre com todas as características ideais dentro da terapia celular: colheita fácil e segura via sistema fechado; transplante autólogo na mesma sessão cirúrgica; resultados previsíveis e reprodutíveis; mínima manipulação [18]. Dessa forma, esse artigo auxilia a literatura da área a ampliar seus dados sobre a técnica, além de difundi-la no campo médico.

CONCLUSÃO

Tendo em vista os bons resultados obtidos pelo nosso grupo e o embasamento científico do tratamento utilizado, acreditamos que o transplante autólogo de MSCs é uma promessa clínica para o tratamento de lesões vasculares complexas. No entanto, novas pesquisas clínicas com maior número de pacientes e maior duração de acompanhamento são necessárias para melhor compreensão e validação do método terapêutico.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1- Frykberg RG, Banks J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Adv Wound Care (New Rochelle). 2015;4(9):560-582
2- Coalson E, Bishop E, Liu W, et al. Stem cell therapy for chronic skin wounds in the era of personalized medicine: From bench to bedside. Genes Dis. 2019;6(4):342-358.
3- Ramsey SD, Newton K, Blough D, et al. Incidence, outcomes, and cost of foot ulcers in patients with diabetes. Diabetes Care 1999; 22:382.
4- Armstrong DG, Boulton AJM, Bus SA. Diabetic Foot Ulcers and Their Recurrence. N Engl J Med 2017; 376:2367.
5- Walsh JW, Hoffstad OJ, Sullivan MO, Margolis DJ. Association of diabetic foot ulcer and death in a population-based cohort from the United Kingdom. Diabet Med 2016; 33:1493.
6- Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284:143–147.
7- Kern S, Eichler H, Stoeve J, Kluter H, Bieback K: Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 2006, 24: 1294-1301. 10.1634/stemcells.2005-0342.
8- Mills JL Sr, Conte MS, Armstrong DG, et al. The Society for Vascular Surgery Lower Extremity Threatened Limb Classification System: risk stratification based on wound, ischemia, and foot infection (WIfI). J Vasc Surg. 2014;59(1):220-34.e342.
9- Centurion P, Noriega A. Fat preserving by laser 1210-nm. J Cosmet Laser Ther. 2013;15(1):2-12.
10- Cerqueira LO, Duarte Júnior EG, Barros ALS, et al. Classificação WifI: o novo sistema de classificação da Society for Vascular Surgery para membros inferiores ameaçados, uma
revisão de literatura. J Vasc Bras. 2020;19:e20190070.
11- Uccelli, A., Moretta, L. & Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat. Rev. Immunol. 8(9), 726–736 (2008).

12- Amable, P. R., Teixeira, M. V., Carias, R. B., Granjeiro, J. M. & Borojevic, R. Protein synthesis and secretion in human mesenchymal cells derived from bone marrow,
adipose tissue and Wharton’s jelly. Stem Cell Res. Ter. 5(2), 53 (2014).
13- Bergers, G. & Song, S. Te role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7(4), 452–464 (2005).
14- Tapia-Rojas S, Mayanga-Herrera A, Enciso-Gutiérrez J.Procedure for culture and identification of Stem Cells from Human lipoaspirated Research Purposes. Peru Med
Exp Salud Publica. 2020;37(3):547-53.
15- Zocchi ML, Vindigni V, Pagani A, et al. Michele L. Zocchi, Vincenzo Vindigni & Andrea Regulatory, ethical, and technical considerations on regenerative technologies and
adipose-derived mesenchymal stem cells. Eur J of Plastic Surgery (2019) 42:531–548
16- Centurión, P., Gamarra, R., Caballero, G. et al. Optimizing harvesting for facial lipografting with a new photochemical stimulation concept: One STEP technique™. Eur
J Plast Surg 43, 733–742 (2020).
17- Armstrong DG, Cohen K, Courric S, Bharara M, Marston W. Diabetic foot ulcers and vascular insufficiency: our population has changed, but our methods have not. J Diabetes Sci Technol. 2011; 5:1591-1595.
18- Alexander RW. Biocellular Regenerative Medicine: Use of Adipose-Derived Stem/Stromal Cells and It's Native Bioactive Matrix. Phys Med Rehabil Clin N Am. 2016;27(4):871-891.